A modulação recíproca da produção de amônia e melanina tem implicações para a virulência criptocócica

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 849 (2023) Citar este artigo

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O fungo Cryptococcus neoformans é o agente causador da criptococose, uma doença que é uniformemente letal, a menos que seja tratada com drogas antifúngicas, mas os regimes atuais são prejudicados pela toxicidade do hospedeiro e resistência do patógeno. Uma abordagem alternativa atraente para combater esta doença mortal é o direcionamento direto dos mecanismos de virulência derivados de patógenos. C. neoformans expressa múltiplos fatores de virulência que foram estudados anteriormente como entidades isoladas. Entre elas, estão a urease, que aumenta o pH fagossômico e promove a invasão cerebral, e a melanização, que protege contra células imunes e tratamentos antifúngicos. Aqui relatamos uma interdependência recíproca entre esses dois fatores de virulência. As células que hidrolisam a ureia liberam gás amônia, que atua à distância para elevar o pH e aumentar as taxas de melanização das células próximas, o que, por sua vez, reduz a secreção de vesículas extracelulares transportadoras de urease. Essa relação recíproca se manifesta como uma propriedade emergente que pode explicar por que tem sido difícil direcionar mecanismos de virulência isolados para o desenvolvimento de medicamentos e defende uma abordagem mais holística que considere o composto de virulência.

Fatores de virulência são características que conferem aos micróbios infecciosos a capacidade de danificar e persistir em hospedeiros infectados, apesar das respostas imunes1. Embora os patógenos tendam a empregar vários fatores de virulência, incluindo revestimentos de superfície, toxinas e enzimas, a maioria dos estudos se concentra na contribuição independente para a patogenicidade de um único fator, sem considerar sua contribuição para o composto de virulência2. Os mecanismos pelos quais os fatores de virulência interagem é um tópico relativamente inexplorado na patogênese microbiana.

C. neoformans expressa um conjunto diversificado de fatores de virulência que incluem uma cápsula polissacarídica, produção de melanina e a expressão de várias enzimas como urease e fosfolipase, entre outras. A cápsula polissacarídica e o pigmento melanina protegem contra fagocitose e explosão oxidativa de células fagocíticas, respectivamente3,4. A urease é uma enzima nutricional que interfere incidentalmente na acidificação fagossômica ao hidrolisar a uréia para gerar amônia5 e desempenha um papel crucial na invasão cerebral6,7, enquanto a fosfolipase danifica as membranas fagossomais dos macrófagos e promove a sobrevivência intracelular8. Há pouca informação sobre como esses fatores de virulência interagem uns com os outros.

Este estudo caracteriza a interação entre a atividade da urease criptocócica e a melanização. A urease é liberada em vesículas extracelulares e hidrolisa a ureia para produzir amônia, que é mostrada aqui como mediadora da ação à distância por meio de sua capacidade de viajar como um gás. A reação de melanização é dependente do pH e, portanto, promovida pelo aumento da produção de amônia pela urease. Verificou-se que o aumento da melanização favorece a persistência de células criptocócicas dentro dos fagossomas e, assim, aumenta a disseminação cerebral por meio de um mecanismo de cavalo de Tróia. A deposição de melanina na parede celular atua como um mecanismo de feedback, reduzindo a produção de vesículas extracelulares para inibir a liberação de urease associada à vesícula. Assim, a urease e a melanina exibem modulação recíproca que fornece vantagens em diferentes estágios da infecção e essa coordenação e sinergia de fatores de virulência resulta em mudanças fenotípicas que não poderiam ser antecipadas a partir do estudo de cada componente isoladamente.

Ao analisar a atividade da urease de C. neoformans em caldo rápido de ureia9, notamos que com o tempo de incubação estendido, a mídia em poços livres de células também aumentou em pH (Fig. 1a, painel esquerdo). A medição da absorbância a 560 nm (A560) para cada poço revelou uma relação linear direta entre a mudança de cor no poço livre de células e o número de células no poço adjacente (Fig. 1a, painel direito). Para determinar se esse fenômeno dependia da atividade da urease, células de tipo selvagem (WT) ou deficientes em urease (ure1∆) foram cultivadas em caldo de ureia em um poço de uma placa de 24 poços juntamente com meio livre de células no restante 23 poços. Após incubação a 30 ˚C por 24 h, a mídia no poço contendo células WT e vários poços circundantes mudaram de cor de amarelo para rosa, enquanto nenhuma mudança de cor foi observada para a placa contendo células ure1∆ (Fig. 1b, painel esquerdo). A relação sigmoidal entre A560 de meio livre de células e a distância para células WT produzindo amônia (Fig. 1b, painel direito) se assemelha a uma curva de titulação de pH para a qual o ponto médio é o pKa. Um ajuste da curva de Boltzmann dos dados dá um valor de ponto médio de 56 mm e sugere que o pH da mídia em oito poços dentro desta distância aumentou para pelo menos 7,9, o pKa de vermelho de fenol em caldo de ureia. Usando um detector portátil de gás amônia com uma faixa de 0–200 ppm, a amônia foi detectada durante leituras de 30 s para culturas cultivadas em caldo de uréia por 24 h a 30 ˚C com uma densidade celular inicial mínima de 2 × 106 células/mL quando a concentração de ureia foi mantida constante em 2% (Fig. 1c, painel esquerdo) ou com uma concentração mínima de ureia de 0,25% e densidade celular constante de 1 × 108 células/mL (Fig. 1c, painel direito). Em ambos os casos, a quantidade cumulativa de amônia produzida durante 24 h foi consideravelmente maior, conforme evidenciado pelo aumento do pH do meio de cultura em densidades celulares e concentrações de uréia ainda mais baixas (Fig. 1c).